Sistem Sekresi Tipe III Pada Bakteri

Secara umum Escherichia coli dan berbagai bakteri Gram-negatif lainnya memiliki kelemahan dalam menyekresikan protein yang dihasilkan secara langsung ke medium pertumbuhan. Hal ini dikarenakan bakteri Gram-negatif memiliki struktur penyusun dinding sel yang kompleks dibandingkan pada bakteri Gram-positif. Susunan tersebut meliputi dari dalam keluar, yaitu: (1) membran dalam, (2) ruang periplasmik, dan (3) membran luar (Gambar 1) (Hueck, 1998).

Protein-protein yang dihasilkan oleh bakteri Gram-negatif disekresikan dari sitoplasma melalui membran dalam dan ruang periplasmik untuk kemudian disisipkan ke membran luar. Sekresi protein ke dalam medium pertumbuhan dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu:

1.    Penggunaan bakteri Gram-positif atau sel eukariot sebagai organisme inang.

Hal ini dikarena keduanya memiliki membran luar yang tipis sehingga dapat menyekresikan protein langsung ke dalam medium.

2.    Menggunakan manipulasi ekspresi gen untuk membuat bakteri Gram-negatif bisa secara langsung menyekresikan proteinnya langsung ke dalam medium pertumbuhan (Majander et al., 2005).

Salah satu manipulasi ekspresi gen yang digunakan pada bakteri Gram-negatif untuk dapat secara langsung menyekresikan protein yang dihasilkan ke dalam medium pertumbuhan adalah dengan melakukan modifikasi pada aparatus sekresi flagellar tipe III. Sekresi flagelar tipe III ini merupakan salah satu jenis type III secretion system (TTSS) yang secara efisien menyekresikan protein filamen flagellin (FliC), serta komponen struktural dan regulator flagellum lainnya dari dalam sitoplasma langsung ke bagian luar tanpa melewati ruang periplasmik secara langsung (Gambar  2). TTSS merupakan sistem sekresi protein independen dari jalur sekresi protein pada umumnya (the general secretory pathway/ SecA-YEG) pada bakteri (Kuwajima et al., 1989; Majander et al., 2005). TTSS ini dimiliki baik pada bakteri Gram-positif maupun Gram-negatif yang diduga juga diperlukan dalam proses patogenesis (Karlinsey et al., 2000).

Hasil penelitian dari Majander et al. (2005) menunjukkan bahwa polipeptida yang disekresikan oleh bakteri Gram-negatif dapat dikeluarkan secara langsung tanpa melalui ruang periplasmik dengan memodifikasi aparatus sekresi flagelar pada Escherichia coli (Gambar 3). Majander et al. (2005) melakukan modifikasi pada aparatus sekresi flagellar tipe III untuk menyekresikan polipeptida heterolog ke dalam medium pertumbuhan dari E.coli. “Sekresi ini dilakukan melalui fusi gen target pengkode protein yang akan disekresikan dengan fragmen DNA yang tidak ditranslasikan sepanjang 173-pb sebelah hulu (upstream) gen pengkode flagellin (5’ UTR) beserta bagian 3’UTR dari gen pengkode flagellin yang berfungsi sebagai terminator transkripsi dari FliC (gen pengkode flagellin) ke dalam gen yang mengkodekan polipeptida yang diinginkan.” Protein flagellin (FliC) ini merupakan salah satu protein yang melimpah di permukaan dan komponen umum dari flagellum bakteri Gram-negatif, dimana setiap filamen mampu menghasilkan ±20.000 kopi protein flagelin. Manipulasi ekspresi gen dengan menggunakan gen pengkode flagelin ini berhasil meningkatkan hasil sekresi protein yang diinginkan pada medium pertumbuhan mencapai 1 sampai 15 mg/l, dimana pada penelitian sebelumnya dilaporkan sekresi protein ekstraseluler dari E. coli cukup rendah yaitu sekitar 100 µg/l. 

Pada isolat E. coli, protein FliC memiliki sekuens dan ukuran molekuler yang beragam. Domain variabel pusat FliC terekspos pada permukaan filamen, sedangkan domain N-terminal dan C-terminal yang terlestarikan mengarah ke bagian dalam dan membentuk inti tersembunyi dalam rongga filamen (Karlinsey et al., 2000). Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa fragmen C-terminal FliC tidak disekresikan dari sel-sel E.coli, sedangkan 183-residu fragmen N-terminal FliC bisa ditemukan di dalam medium pertumbuhan (Majander et al., 2005).

Berdasarkan temuan tersebut di atas, Majander et al. (2005) mengujikan fragmen DNA yang mengkode asam amino 183 N-terminal FliC_MG1655 (disekresi dari E. coli MKS12) dari promoter trc dan dari 173-pb 5’-untranslated region (5’UTR) FliC yang memiliki promoter FliC. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa polipeptida FliC_1-183 ditemukan dalam sel tapi tidak dalam medium pertumbuhan E. coli MKS12 (p₁₈₃FliCtrc), sedangkan E. coli MKS12 (p₁₈₃FliC_5’) mampu menyekresikan polipeptida FliC_1-183 ke dalam medium pertumbuhan. Polipeptida N-terminal yang lebih pendek FliC_1-80 dan FliC_1-130 secara efisien disekresikan ketika fragmen gen cocok diekspresikan dari promoter FliC. N-terminal pada fragmen FliC yang kekurangan C-terminal membutuhkan sekuens 5’-UTR FliC untuk dapat melakukan sekresi dengan efisien (Gambar 4).

 

MEKANISME SEKRESI PROTEIN MELALUI TTSS

TTSS dapat menyekresikan baik protein virulensi dan subunit flagela yang dihasilkan bakteri yang dalam proses sekresinya memerlukan chaperone sitosol (Bennett and Hughes, 2000). Dalam beberapa penelitian, sekresi protein dikumpulkan di dalam sel tanpa dibentuknya chaperone dan ini menyebabkan sebagian protein secara cepat terdegradasi sebelum dikeluarkan ke medium pertumbuhan. Sekresi protein melalui TTSS memerlukan sinyal sekresi N-terminal non-homolog dari asam amino yang dihasilkan bakteri untuk membedakan substrat yang akan disekresi melalui sistem ini. Dalam beberapa penelitian mengenai sekresi protein virulensi yang dihasilkan bakteri, N-terminal mendapatkan sinyal sekresi dari 5’ mRNA untuk dapat menyekresikan protein tersebut.  Karena proses transkripsi dan translasi tergabung pada bakteri, diperkirakan proses ini yang menyebabkan proses translasi mungkin terjadi ketika proses sekresi (Anderson and Schneewind, 1999). 

Banyak cara yang terjadi pada TTSS yang bertujuan untuk pengenalan substrat yang akan disekresi. Salah satu caranya adalah dengan sinyal mRNA yang dihasilkan saat sekresi pada tahap co-translasi yang disintesis langsung ketika akan menyekresikan protein. Cara kedua melibatkan sinyal pengenalan asam amino yang dimediasi oleh chaperone untuk sekresi protein (Anderson and Schneewind, 1999). Hasil penelitian Karlinsey et al. (2000) menunjukkan bahwa kedua cara tersebut di atas tidak berlangsung secara terpisah, melainkan saling memengaruhi dan mendukung dalam sekresi protein dengan sistem TTSS dengan sama-sama menggunakan mRNA dan sinyal sekresi asam amino N-terminal.   

Ada lebih dari 50 gen dalam flagellar dan kemotaksis peregulasi. Gen ini ada dalam operon dengan 3 promoter yang saat ini diketahui terbagi menjadi 3 kelas, yaitu: operon  kelas 1 (flhC, flhD), operon kelas 2 (flgAMN, flgBCDEFGHIJK, flhBAE, fliAZY, fliDST, fliE, fliFGHIJK, fliLMNOPQR), dan operon kelas 3 (flgMN, fliC, fliB, flgKL, fliDST, fliBA, motABcheAW, tarcheRBYZ, tsr, aer) (Kutsukake et al., 1990). Promoter kelas 1 mentraskripsikan operon induk flagellar, yaitu flhC dan flhD. Protein flhC dan flhD akan membentuk kompleks heterodimer yang mengatur faktor transkripsi σ⁷⁰-dependent dari promoter kelas 2. Operon kelas 2 mengkodekan struktur dan perakitan protein yang dibutuhkan untuk biosintesis dari struktur penggerak flagellar, yang dikenal dengan sebutan hook-basal body (HBB). Selain protein HBB, terdapat 2 protein regulator lagi yang ditraskripsi pada promoter kelas 2, yaitu FlgM dan FliA (σ²⁸). Gen FliA mengkodekan faktor transkripsi alternatif, yaitu σ²⁸ yang secara khusus diperlukan promoter kelas 3 dalam proses transkripsinya. Promoter kelas 3 ini berperan dalam mentraskripsikan gen yang menghasilkan produk yang diperlukan diakhir perakitan flagellar, terutama filamen ekternal pada flagellar. Protein FlgM/ FliC mengikat σ²⁸ secara langsung untuk mencegah promoter kelas 3 melakukan transkripsi sampai pembentukan HBB selesai. Setelah HBB selesai dibentuk, FlgM dikeluarkan dari sel untuk melepas ikatannya terhadap σ²⁸ sehingga kelas 3 dapat melakukan traskripsi. Dengan cara ini, filamen eksternal (propeller) tidak dibentuk sampai HBB terbentuk terlebih dahulu. Sejumlah gen flagellar termasuk FlgK, FlgL, FlgM, FlgN, FliC, FliD, FliS dipengaruhi oleh transkripsi dari promoter kelas 2 dan kelas 3 (Gambar 5) (Karlinsey et al., 2000).

TTSS melakukan proses sekresi protein yang dihasilkan bakteri ke medium pertumbuhan dengan menggabungkan fungsi mRNA dan sinyal sekresi asam amino. Karlinsey et al. (2000) melakukan penelitian mengenai mekanisme TTSS ini menggunakan protein FlgM, namun mekanisme ini juga berlangsung sama untuk protein FliC (fusi  gen target protein yang akan disekresikan dengan fragmen DNA yang tidak ditranslasikan sepanjang 173-pb sebelah hulu (upstream) gen pengkode flagellin (5’ UTR), dan bagian 3’UTR dari gen pengkode flagellin yang juga berfungsi sebagai terminator transkripsi dari FliC (gen pengkode flagellin) ke dalam gen yang mengkodekan polipeptida yang diinginkan).

Pada mekanisme sekresi seperti pada Gambar 6, hook-basal body (HBB) merupakan saluran sekresi protein. Transkripsi kelas 3 pada gen FlgM/ FliC ditujukkan ke saluran sekresi oleh protein ribosom S1-homolog yaitu Flk, dimana merupakan tempat co-translasi berlangsung. Chaperone untuk sekresi FlgM/ FliC dibentuk akibat adanya sinyal peptida yang dihasilkan oleh N-terminal, yaitu FlgN yang bekerja sama dengan Flk untuk mengikat FlgM selama transkripsi kelas 3. Flk dan FlgN memfasilitasi proses translasi FlgM kelas 3 dan proses translasi protein FlgM/ FliC yang akan disekresikan. Hasil transkripsi FlgM/ FliC kelas 2 ditranslasi di sitoplasma menggunakan subunit protein ribosom S1. Kemudian FlgM/ FliC di sitoplasma mengikat faktor transkripsi σ²⁸-dependent untuk menghambat proses transkripsi sampai terbentuknya HBB. Ketika HBB selesai terbentuk, sinyal sekresi asam amino akan menyebabkan FlgM/ FliC sitoplasma melepaskan faktor transkripsi σ²⁸-dependent sehingga transkripsi dan translasi terjadi, serta HBB menggerakan flagellar untuk menyekresikan protein FlgM/ FliC beserta protein yang dikodekan oleh gen yang telah difusikan dengan fragmen DNA yang tidak ditranslasikan sepanjang 173-pb sebelah hulu (upstream) yang merupakan gen pengkode  FlgM/ FliC (flagellin) keluar sel (ke medium pertumbuhan) (Karlinsey et al., 2000).

DAFTAR PUSTAKA:

1.    Anderson, D.M., and Schneewind. (1999). Yersinia enterocolitica type III secretion: an mRNA signal that couples translation and secretion of YopQ. Mol. Microbiol. 31, 1139-1148.

2.    Bennett, J.C., and Hughes, C. (2000). From flagellum assembly to virulence: the extended family of type III export chaperones. Trends Microbiol. 8, 202–204.

3.    Focosci, D. (2005). Physiology of Bacteria (ex eubacteria) Domain/ Superkingdom. http://focosci.altervista.org/sitemap.html. Diakses tanggal 17 Februari 2014.

4.    Hueck, C.J. (1998). Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animal and plants. Microbiology and Molecular Biology. 62(2): 379-433.

5.    Karlinsey, J.E., Lonner, J., Kit, L.B., and Kelly, T.H. (2000). Translation/ secretion coupling by type III secretion systems. Cell. 102, 487-497.

6.    Kutsukake, K., Ohya, Y., and Iino, T. (1990). Transcriptional analysis of the flagellar regulon of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 172, 741-747.

7.    Kuwajima, G. (1989). Export of an N-terminal fragment of Escherichia coli flagellin by a flagellum-spesific pathway. Cell Biology. 86, 4953-4957.

8.    Macnab, R.M. (2004). Type III flagellar protein export and flagellar assembly. Biochimica et biophysica acta, 1694, 207-217.

9.    Majander, K., Anton, L., Jenni, A., Hannun, L., Mirko, B., Timo, K.K., and Benita, W. (2005). Extracellular secretion of polypeptides using a modified Escherichia coli flagellar secretion apparatus. Nature biotechnology, 23(4), 475-481.